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本制品是一种利用比色法，简单、快速、高灵敏地用于组织、细胞以及组织和细胞分离的线粒体样品中细胞色素C氧化酶活性检测的试剂盒。

细胞色素C氧化酶可以催化还原型细胞色素C (Reduced cytochrome C/Cyt C-)生成氧化型细胞色素C (Oxidized cytochrome C/Cyt C+)，还原型细胞色素C在550nm处具有特征吸收峰，通过测量550nm下还原型细胞色素C的吸光度值变化即可反映细胞色素C氧化酶的活性。样品中细胞色素C氧化酶的活性越高，剩余的还原型细胞色素C的量越少，细胞色素C氧化酶的活性与反应体系中残留的还原型细胞色素C的含量成反比。

图1．细胞色素C氧化酶活性检测试剂盒检测原理图。

组分	规格
BalbLysis Buffer A for Metabolic Assay	15mL
Assay Buffer	25mL
Cytochrome C	1管
Cytochrome C Reducer(20X)	200μL

保存：-20℃，避光，有效期1年。

细胞色素C氧化酶(Cytochrome C oxidase,Cox/CytOx/CcO)，又称细胞色素氧化酶、线粒体复合物Ⅳ (Complex IV)，是一种大型跨膜蛋白复合物，广泛存在于细菌、古细菌中，以及真核生物的线粒体中。细胞色素C氧化酶是线粒体电子传递链末端的氧化酶，通过细胞色素C的电子传递与氧化磷酸化过程耦合，为细胞提供能量。一些抑制剂(如氰化物、叠氮化物和一氧化碳)与细胞色素C氧化酶结合，抑制其功能，导致细胞代谢活性的整体降低；一氧化氮和硫化氢与细胞色素C氧化酶上的调节位点结合，从而抑制细胞色素C氧化酶，并降低细胞的呼吸速率。涉及改变细胞色素C氧化酶功能或结构的基因突变可导致严重、致命的代谢紊乱。

• 本试剂盒检测灵敏度高，样品用量少。本试剂盒可以检测低至100ng左右的小鼠肝脏样品、50ng左右的小鼠肝脏线粒体样品中的细胞色素C氧化酶活性。
  
• 本制品更加安全健康。国内外相似产品均使用有异味且不太稳定的二硫苏糖醇(DTT)作为细胞色素C的还原剂，而本制品避免使用了DTT，无气味，确保使用效果的情况下更加安全健康。
  
• 本试剂盒适用范围广，检测速度快。本试剂盒可用于测定包括哺乳动物、植物、细菌等几乎所有来源的线粒体细胞色素C氧化酶的活性，包括纯化的线粒体、细胞以及组织提取物，还可用于检测亚细胞成分中是否存在线粒体等。整个检测过程约30分钟即可完成。
  
• 本试剂盒提供的检测裂解液有一定的通用性。使用本试剂盒中的BalbLysis Buffer A for Metabolic Assay裂解获得的细胞或组织样品，也可以用于百奥莱博的其它代谢类试剂盒中同样使用BalbLysis Buffer A for Metabolic Assay进行裂解的样品检测，通用性强；而且还可用于检测蛋白浓度、进行SDS-PAGE或一些较易溶解蛋白的Western检测。

图2．细胞色素C氧化酶活性检测试剂盒用于HeLa细胞和小鼠肝脏样品、HeLa细胞和小鼠肝脏线粒体样品的检测效果图。图A为本试剂盒检测1μg蛋白量小鼠肝脏样品(Mouse Liver)和11μg蛋白量HeLa细胞样品(HeLa Cell)时反应30分钟内的信号变化图，样品(Total Cell Lysate)由本试剂盒中提供的BalbLysis Buffer A for Metabolic Assay制备；图B为本试剂盒检测0.6μg蛋白量小鼠肝脏线粒体样品(Mouse Liver)和4.5μg蛋白量HeLa细胞线粒体样品(HeLa Cell)时反应10分钟内的信号变化图，样品(Mitochondrial Lysate)由动物组织线粒体纯化试剂盒和细胞线粒体提取试剂盒制备。实测数据会因实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。

• Cytochrome C配制成细胞色素C储备液后，尽管经测试反复冻融5次对于其检测效果无显著影响，为取得良好的使用效果，建议适当分装并-20℃保存。
  
• 由于样品中的细胞色素C氧化酶不太稳定，在冻融过程中易出现活性下降，建议使用新鲜样品进行检测。如果不立即测定，制备好的样品须适当分装后置于-80℃冻存，避免反复冻融。
  
• 加入细胞色素C氧化酶检测工作液后的第一次读数，例如0分钟时A550读值不宜低于0.4。如果读数低于0.4，说明样品中的细胞色素C氧化酶活力太高，需要对样品进行适当稀释或者减少样品的用量，否则反应很快就进入平台期，无法获取正常的检测数据。
  
• 本试剂盒检测时涉及氧化还原反应，因此所有氧化剂或还原剂都会干扰本试剂盒的检测。
  
• Assay Buffer需要完全解冻并平衡至室温后再使用，否则会影响检测结果。其它各种溶液使用时应在冰上进行。

• 样品的准备
  
  • 细胞或组织样品的准备：对于培养的贴壁细胞，PBS洗涤一次并吸净残留液体。对于培养的悬浮细胞，先适当离心(如100～500×g，5分钟)收集细胞到离心管内，弃上清并吸净残留液体。按照每100万细胞加入100～200μL BalbLysis Buffer A for Metabolic Assay的比例加入裂解液，适当吹打，冰浴5～10分钟以充分裂解细胞。4℃约12000×g离心3～5分钟，取上清用于后续检测。对于哺乳动物或植物组织样品，分别按照每10mg组织加入100μL或每50mg组织加入200μL BalbLysis Buffer A for Metabolic Assay的比例，使用组织研磨仪或玻璃匀浆器在约4℃或冰浴等低温条件下进行匀浆。4℃约12000×g离心3～5分钟，取上清用于后续检测。以上所有操作均需在4℃或冰上操作。制备好的细胞或组织样品如果不能立即检测，可以-20℃或-80℃冻存。
    
  • 细菌样品的准备：取1.5～4mL OD600为0.5～2.0的菌液，5000×g 4℃离心10分钟，弃上清。用0.2mL BalbLytic细菌蛋白提取液重悬细胞，可短暂涡旋混合以充分重悬。使用组织研磨仪或玻璃匀浆器在约4℃或冰浴等低温条件下进行匀浆。室温孵育15分钟。12000～16000×g (16000×g更佳) 4℃离心5分钟。小心吸取上清用于后继检测。制备好的细菌样品如果不能立即检测，可以-20℃或-80℃冻存。
    
  • 细胞线粒体样品的准备：推荐使用细胞线粒体提取试剂盒并参考使用说明制备细胞线粒体样品，使用线粒体裂解液进行裂解。
    
  • 组织线粒体样品的准备：推荐使用动物组织线粒体纯化试剂盒并参考使用说明制备组织线粒体样品，使用线粒体裂解液进行裂解。
    
  • 上述各种蛋白样品或线粒体裂解液样品，可以使用BCA蛋白浓度测定试剂盒(货号：YT036、YT037)或Bradford蛋白浓度测定试剂盒(兼容去垢剂)测定蛋白浓度，记录蛋白浓度为C。对于细胞色素C氧化酶活力较高的组织样品，每次检测通常需要0.1～5μg的蛋白样品、0.05～2μg的线粒体蛋白样品，而对于细胞色素C氧化酶活力较低的样品例如某些细胞样品，每次检测可能需要0.2～20μg的蛋白样品、0.1～10μg的线粒体蛋白样品。准备好的样品建议在当天完成检测。
    
    • 细胞按照相应线粒体分离试剂盒制备成线粒体样品后，大约可以用于50次检测。组织按照相应线粒体分离试剂盒制备成线粒体样品后，大约可以用500次检测。
    • 如果发现样品中细胞色素C氧化酶的活力过高，可以使用Assay Buffer或BalbLysis Buffer A for Metabolic Assay进行适当稀释(如果检测细胞或组织线粒体样品，可以使用Assay Buffer；如果检测BalbLysis Buffer A for Metabolic Assay制备的细胞或组织样品，可以使用BalbLysis Buffer A for Metabolic Assay)。如果样品中细胞色素C氧化酶的活力过低，则需适当增加蛋白用量。
    • 以上所有操作均需在4℃或冰上操作。制备好的细胞或组织样品如果不能立即检测，可以分装后-20℃或-80℃冻存。
    • 对于植物细胞或组织、细菌样品的准备，也可以用其它合适的裂解液进行裂解，不同裂解液制备的样品的测定效果可能存在一定的差异。
• 试剂盒的准备
  
  • 融解Assay Buffer，平衡至室温后混匀备用。其它试剂存放于冰浴备用，使用完毕后宜立即按照试剂盒要求的条件保存。
    
  • 细胞色素C储备液的配制：在本试剂盒提供的1管Cytochrome C中加入200μL Assay Buffer，溶解并混匀，即为细胞色素C储备液。除立即待用部分外，其余细胞色素C储备液适当分装后-20℃保存。
    
    • Cytochrome C在打开管盖前，建议在离心机中约5000×g离心10秒，使附着在管盖或管壁上的蛋白聚集于管底。
  • 还原型细胞色素C溶液的配制：按照每个反应20μL的体积配制适量的还原型细胞色素C溶液。均匀混合17μL Assay Buffer、2μL细胞色素C储备液、1μL Cytochrome C Reducer(20X)，室温孵育15分钟，即可配制成20μL还原型细胞色素C溶液。根据待检测样品的数量，配制适量的还原型细胞色素C溶液。具体配制方法参考下表。配制好的还原型细胞色素C溶液如果置于4℃或冰浴避光保存，可以在当天使用，但建议尽量现配现用。
    

    样品(μL)	1	10	20	50
    Assay Buffer	17	170	340	850
    细胞色素C储备液	2	20	40	100
    Cytochrome C Reducer(20X)	1	10	20	50
    还原型细胞色素C溶液	20	200	400	1000

  • 细胞色素C氧化酶检测工作液的准备：将配制好的还原型细胞色素C溶液按照1:5的比例加入Assay Buffer进行稀释，例如每20μL还原型细胞色素C溶液加入100μL Assay Buffer，混匀后即得细胞色素C氧化酶检测工作液。每个反应需要120μL细胞色素C氧化酶检测工作液。加入细胞色素C氧化酶检测工作液进行反应前需要确保平衡至预期的反应温度。
• 样品测定
  
  • 取1～10μL样品或稀释后的样品至96孔板样品孔中，并相应地加入Assay Buffer或BalbLysis Buffer A for Metabolic Assay至样品孔中，补足至10μL。同时设置仅含Assay Buffer或BalbLysis Buffer A for Metabolic Assay的孔为空白对照(Blank Control)。
    
    • 为确保样品吸光度读值在合理范围内，建议进行预实验将样品设置多个稀释倍数，以确定样品中细胞色素C氧化酶的大致活性。如果样品孔的初始信号和空白对照的差值太小或者太大，请调整样品的稀释倍数或者样品的量。样品总稀释倍数记为dil (例如本步骤中对样品进行了10倍稀释，加入的“稀释后的样品”为5μL，则dil=10×10/5=20)。
  • 各孔加入细胞色素C氧化酶检测工作液120μL，混匀，以起始反应。
    
    • 加入细胞色素C氧化酶检测工作液后反应会立即开始，可以在低温条件下操作或使用排枪操作以减小各孔间因加入细胞色素C氧化酶检测工作液的时间先后差异而导致的误差。
  • 立即使用酶标仪或微量分光光度计测定A550，此时记录为0分钟读值为A1 (Time 1)。连续测定5分钟或自动每隔1分钟测定一次A550。如果仪器不具备相应功能，可以手工操作，每隔1分钟记录A550值，至少连续记录5分钟，获得6个点的数据。
    
    • 如果仪器可以设置温度，把温度设置在25℃，否则可以通过空调调节室温到25℃，待预计仪器也达到25℃后再开始加入细胞色素C氧化酶检测工作液以起始反应。如果酶标仪没有温控功能，也可以在室温测定，但这样检测出来的是该特定温条件下的酶活性，不同的温度条件测得酶活性会有所不同，可以根据物种属性等酌情选择适当的温度进行酶活性检测。
    • 连续测定的时间可以根据样品中细胞色素C氧化酶的活力来调整，但是须确保获得3个点的有效数据。对于细胞色素C氧化酶的活力较高的样品，例如肝脏等组织线粒体样品，建议测定5分钟或10分钟，对应的测定间隔时间设为1分钟或2分钟；对于细胞色素C氧化酶的活力较低的样品，例如HeLa等细胞样品，可以延长测定时间为15、20或者30分钟，对应的测定间隔时间设为3、4或5分钟。也可以连续测定20或30分钟，每隔1分钟测定1次，最后取吸光度变化呈线性的时间段内的数据用于分析(记录反应时间为T1和T2，相应读取的吸光度数值为A(Time T1)和A(Time T2))。
    • 如果样品的第一次读数，例如0分钟时A(Time T1)读值低于0.4，说明样品中的细胞色素C氧化酶活力太高，需要将样品适当稀释或者减少样品的用量。
• 样品中细胞色素C氧化酶酶活力的计算
  
  • 细胞色素C氧化酶酶活力单位的定义：1个酶活力单位(1 unit)在25℃，pH7.2，在1分钟内可以催化1微摩尔还原型细胞色素C转变成氧化型细胞色素C。1U=1000mU。也可以根据实验需求，设定不同温度的细胞色素C氧化酶活性单位的定义。
    
  • 对于细胞色素C氧化酶溶液：1mU/mL＝1nmol还原型细胞色素C/min/mL＝(ΔA/T)/(εμM×L(cm))，即相当于：
    [检测体系中细胞色素C氧化酶活力]＝(ΔA/T)/(εμM×L(cm))=[(△A_Sample－△A_{Blank Control})/T]/(εμM×L(cm))
    △A_Sample＝A_{Sample^{(Time T1)}}－A_{Sample^{(Time T2)}}
    △A_{Blank Control}＝A_{Blank Control^{(Time T1)}}－A_{Blank Control^{(Time T2)}}
    [样品中细胞色素C氧化酶活力]＝[(△A/T)/(εμM×L(cm))]×[dil×(V(ml)/V_Sample(mL))]/[样品中的蛋白浓度]
    
    • [样品中细胞色素C氧化酶活力]的单位为：U/mg蛋白或mU/mg蛋白；
      
    • T为步骤3c的样品反应时间(min)；
      
    • εμM为摩尔消光系数，还原型与氧化型细胞色素C在A550的摩尔消光系数差值为0.02184μM^-1·cm^-1；
      
    • L(cm)为测吸光度时的路径长度：130μL样品在一般的96孔中的高度约为0.3588cm，如果使用不同的反应孔，请注意修改为溶液在该孔中的高度；
      
    • dil为步骤3a中样品的稀释倍数；
      
    • V(ml)为反应体系，本反应体系为0.13mL；
      
    • V_Sample(ml)为反应体系中样品的体积，本反应体系中样品的体积为0.01mL；
      
    • 样品中的蛋白浓度为步骤1e测得的样品蛋白浓度C(mg/ml)。
  • 计算示例：样品的蛋白浓度经测定为12.16mg/mL，用样品稀释液稀释100倍后，取5μL稀释后的样品进行测定，则稀释倍数dil为200，测定时间设为10分钟。
    如果0分钟时的A_{Sample^{(Time 1)}}＝0.4983，A_{Blank Control^{(Time 1)}}＝0.5488，
    10分钟时的A_{Sample^{(Time 2)}}＝0.2969，A_{Blank Control^{(Time 2)}}＝0.5419，
    则△A_Sample＝0.4983－0.2969＝0.2014，△A_{Blank Control}＝0.5488-0.5419＝0.0069，
    △A＝△A_Sample－△A_{Blank Control}＝0.2014－0.0069＝0.1945，那么：
    [样品中细胞色素C氧化酶酶活力]=[(0.1945/10)/(0.02184×0.3588)]×[200×0.13/0.01]/12.16＝531.68mU/mg(蛋白)

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